22/10/2024
𝐂𝐚́𝐜 𝐛𝐢𝐞̣̂𝐧 𝐩𝐡𝐚́𝐩 𝐩𝐡𝐨̀𝐧𝐠 𝐧𝐠𝐮̛̀𝐚 𝐯𝐚̀ 𝐤𝐢𝐞̂̉𝐦 𝐬𝐨𝐚́𝐭 𝐧𝐡𝐢𝐞̂̃𝐦 𝐧𝐨̣̂𝐢 𝐬𝐢𝐧𝐡 𝐭𝐫𝐨𝐧𝐠 𝐧𝐮𝐨̂𝐢 𝐜𝐚̂́𝐲 𝐦𝐨̂ 𝐭𝐡𝐮̛̣𝐜 𝐯𝐚̣̂𝐭
Vi sinh vật nội sinh (Endophytes) thường được tìm thấy trong các mô thực vật và rất khó loại bỏ hoàn toàn bằng các phương pháp thông thường. Khi mô thực vật được nuôi cấy in vitro, những vi khuẩn nội sinh này có thể dễ dàng gây ô nhiễm. Trong điều kiện khử trùng thông thường, nhiễm do vi sinh vật nội sinh gây ra chiếm 1/4 tổng số nguồn gây nhiễm. Việc nhiễm xảy ra ở giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, thường dẫn đến giảm hiệu quả tăng sinh, làm chậm sự phát triển của vật chất, tăng quá trình thủy tinh hóa ở cây con và thậm chí là thất bại trong nuôi cấy. Xảy ra ở giai đoạn muộn hơn sẽ gây khó khăn cho việc cấy ghép và làm chết cây con nuôi cấy mô. Ngoài ra, ô nhiễm có thể gây đột biến vật liệu di truyền của vật liệu nuôi cấy.
𝟏. Đ𝐚̣̆𝐜 đ𝐢𝐞̂̉𝐦 𝐧𝐡𝐢𝐞̂̃𝐦 𝐝𝐨 𝐧𝐨̣̂𝐢 𝐬𝐢𝐧𝐡 𝐭𝐡𝐮̛̣𝐜 𝐯𝐚̣̂𝐭
1.1 𝑺𝒖̛̣ 𝒌𝒉𝒂́𝒄 𝒃𝒊𝒆̣̂𝒕 𝒈𝒊𝒖̛̃𝒂 𝒏𝒉𝒊𝒆̂̃𝒎 𝒗𝒊 𝒌𝒉𝒖𝒂̂̉𝒏 𝒏𝒐̣̂𝒊 𝒔𝒊𝒏𝒉 𝒗𝒂̀ 𝒏𝒉𝒊𝒆̂̃𝒎 𝒗𝒊 𝒌𝒉𝒖𝒂̂̉𝒏 𝒃𝒆̂̀ 𝒎𝒂̣̆𝒕
Vi sinh vật nội sinh (endophyte tồn tại bên trong hoặc giữa các tế bào thực vật và không dễ dàng phát hiện được bằng mắt thường trong vài thế hệ nuôi cấy đầu tiên sau khi cấy mẫu. Trong nuôi cấy sơ cấp, ô nhiễm do vi khuẩn bề mặt thường xuất hiện 2-3 ngày sau khi cấy, biểu hiện dưới dạng vết nước, vết dầu, b**g bóng hoặc co rút xuất hiện màu đỏ hoặc vàng xung quanh mẫu hoặc trên bề mặt môi trường nuôi cấy, màu trắng đục. khuẩn lạc màu trắng và các màu khác. Nếu không có triệu chứng nào trong vòng 3-5 ngày sau khi tiêm chủng nhưng các khuẩn lạc tiếp tục xuất hiện trong quá trình nuôi cấy tiếp theo thì nguyên nhân có thể là do vi khuẩn nội sinh. Nói chung, ô nhiễm do nội sinh xảy ra 5 ngày sau khi cấy và vi khuẩn gây ô nhiễm phát triển từ phần trên của môi trường nuôi cấy.
1.2 𝑺𝒖̛̣ 𝒑𝒉𝒂̂𝒏 𝒃𝒐̂́ 𝒄𝒖̉𝒂 𝒗𝒊 𝒔𝒊𝒏𝒉 𝒗𝒂̣̂𝒕 𝒏𝒐̣̂𝒊 𝒔𝒊𝒏𝒉 𝒕𝒉𝒖̛̣𝒄 𝒗𝒂̣̂𝒕
Kiểu phân bố của vi khuẩn nội sinh phụ thuộc vào vật chủ và loại vi khuẩn nội sinh. Có sự khác biệt về sự phân bố ở các vật chủ khác nhau và ở các cơ quan khác nhau của cùng một vật chủ. Ngoài ra, nó còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như loại cây trồng, môi trường và khí hậu. Nhìn chung, vật liệu lâu năm mang nhiều vi khuẩn hơn; vật liệu thu được trên đồng ruộng mang nhiều vi khuẩn hơn vật liệu trong nhà kính; vật liệu nhà kính mang nhiều vi khuẩn hơn vật liệu thủy canh; vật liệu chưa tiếp xúc với ánh sáng mặt trời có nhiều vi khuẩn hơn vật liệu đã tiếp xúc với ánh sáng mặt trời. Việc lựa chọn các phôi cực kỳ trẻ hoặc các đầu chồi non có ít vi khuẩn hơn làm vật mẫu có thể làm giảm nhiễm nội sinh.
𝟐. 𝐂𝐚́𝐜 𝐛𝐢𝐞̣̂𝐧 𝐩𝐡𝐚́𝐩 𝐩𝐡𝐨̀𝐧𝐠 𝐧𝐠𝐮̛̀𝐚 𝐧𝐡𝐢𝐞̂̃𝐦 𝐧𝐨̣̂𝐢 𝐬𝐢𝐧𝐡 𝐭𝐫𝐨𝐧𝐠 𝐧𝐮𝐨̂𝐢 𝐜𝐚̂́𝐲 𝐦𝐨̂
Thông qua các biện pháp như lựa chọn mẫu vật, tiền xử lý vật liệu, kiểm soát môi trường nuôi cấy mô và sử dụng thuốc diệt nấm và kháng sinh, tỷ lệ ô nhiễm nội sinh có thể được giảm thiểu một cách hiệu quả.
2.1. 𝑳𝒖̛̣𝒂 𝒄𝒉𝒐̣𝒏 𝒎𝒂̂̃𝒖 𝒗𝒂̣̂𝒕
Rễ, củ, củ mọc trong đất mang theo rất nhiều vi khuẩn. Vật liệu có diện tích bề mặt tương đối lớn mang nhiều vi khuẩn hơn. Vì vậy, nên chọn càng nhiều ngọn chồi non và phôi càng tốt, đồng thời nên chọn vật liệu thực vật trong môi trường sạch sẽ làm vật mẫu.
2.2 𝑻𝒊𝒆̂̀𝒏 𝒙𝒖̛̉ 𝒍𝒚́ 𝒗𝒂̣̂𝒕 𝒍𝒊𝒆̣̂𝒖
2.2.1 𝑆𝑢̛̉ 𝑑𝑢̣𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑢̛𝑜̛𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑎́𝑝 𝑡𝑟𝑜̂̀𝑛𝑔 đ𝑒̂̉ 𝑔𝑖𝑎̉𝑚 𝑡𝑎̉𝑖 𝑙𝑢̛𝑜̛̣𝑛𝑔 𝑣𝑖 𝑘ℎ𝑢𝑎̂̉𝑛 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑣𝑎̣̂𝑡 𝑙𝑖𝑒̣̂𝑢 𝑣𝑎̀𝑜 𝑚𝑎̂̃𝑢 𝑏𝑎𝑛 đ𝑎̂̀𝑢
Các phương pháp trồng/chăm sóc để giảm lượng vi khuẩn trong mẫu vật chủ yếu bao gồm thúc đẩy chồi mới, nuôi cấy trong tối và thủy canh.
2.2.2 𝑋𝑢̛̉ 𝑙𝑦́ 𝑐𝑎̂𝑦 𝑚𝑒̣ 𝑏𝑎̆̀𝑛𝑔 𝑡ℎ𝑢𝑜̂́𝑐 𝑑𝑖𝑒̣̂𝑡 𝑛𝑎̂́𝑚 ℎ𝑜𝑎̣̆𝑐 𝑘ℎ𝑎́𝑛𝑔 𝑠𝑖𝑛ℎ
Sử dụng thuốc diệt nấm hoặc thuốc kháng sinh để khử trùng cây mẹ trong nhiều ngày có thể làm giảm lượng vi khuẩn mang theo. Ví dụ, phun thuốc nấm nội hấp 2-3 ngày một lần, nồng độ không quá cao. Sau nửa tháng đến một tháng, lượng vi khuẩn nội sinh trong cây mẹ có thể được kiểm soát một cách hiệu quả. Đồng thời, để ngăn chặn vi khuẩn nội sinh phát triển kháng thuốc, nên sử dụng kết hợp kháng sinh và thuốc diệt nấm.
2.2.3 𝐶𝑎́𝑐 𝑝ℎ𝑢̛𝑜̛𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑎́𝑝 𝑘ℎ𝑎́𝑐
Sử dụng các phương pháp khử trùng đặc biệt. Ví dụ, sử dụng phương pháp giảm áp để loại bỏ khí khỏi mô thực vật giúp chất khử trùng xâm nhập vào mô dễ dàng hơn và nâng cao hiệu quả khử trùng. Xử lý sốc nhiệt có thể làm giảm hiệu quả tỷ lệ nhiễm nội sinh.
2.3 𝑻𝒉𝒂𝒚 đ𝒐̂̉𝒊 đ𝒊𝒆̂̀𝒖 𝒌𝒊𝒆̣̂𝒏 𝒎𝒐̂𝒊 𝒕𝒓𝒖̛𝒐̛̀𝒏𝒈 𝒏𝒖𝒐̂𝒊 𝒄𝒂̂́𝒚
2.3.1 𝐵𝑜̂̉ 𝑠𝑢𝑛𝑔 𝑐ℎ𝑎̂́𝑡 𝑘𝑖̀𝑚 𝑘ℎ𝑢𝑎̂̉𝑛 𝑣𝑎̀𝑜 𝑚𝑜̂𝑖 𝑡𝑟𝑢̛𝑜̛̀𝑛𝑔 𝑛𝑢𝑜̂𝑖 𝑐𝑎̂́𝑦
Việc bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy có thể ngăn ngừa ô nhiễm vi khuẩn một cách hiệu quả. Thêm carbenicillin (250 mg/L) + kanamycin (50 mg/L) vào môi trường nuôi cấy Begonia để đạt được hiệu quả khử khuẩn tốt. Thêm 40 mg/L tetracycline vào môi trường nuôi cấy nho có thể ức chế hiệu quả sự phát triển của vi khuẩn nội sinh và tác dụng kháng khuẩn của nó đối với các giống nho khác nhau là khác nhau. Thêm 300 mg/L penicillin natri và 100 mg/L streptomycin vào môi trường nuôi cấy Ulmus elata để đạt được tỷ lệ ô nhiễm tương đối thấp.
Việc bổ sung thuốc diệt nấm vào môi trường nuôi cấy có thể làm giảm sự xuất hiện của ô nhiễm nấm nội sinh. Thêm 50% carbendazim vào môi trường nuôi cấy Anoectochilus có tỷ lệ kìm khuẩn là 100%. Thêm 0,5-1,0 mg/L Peflon vào môi trường nuôi cấy có thể kiểm soát hiệu quả tình trạng nhiễm nấm trong quá trình nuôi cấy phôi lan. Môi trường nuôi cấy sử dụng nồng độ 800 lần bột thấm kẽm Duofu 80% có tác dụng tốt trong việc giảm tỷ lệ ô nhiễm.
2.3.2 Đ𝑖𝑒̂̀𝑢 𝑐ℎ𝑖̉𝑛ℎ 𝑡ℎ𝑎̀𝑛ℎ 𝑝ℎ𝑎̂̀𝑛 𝑚𝑜̂𝑖 𝑡𝑟𝑢̛𝑜̛̀𝑛𝑔 𝑛𝑢𝑜̂𝑖 𝑐𝑎̂́𝑦
Sự phát triển của vi sinh vật nội sinh đòi hỏi những điều kiện dinh dưỡng nhất định. Bằng cách thêm hoặc loại bỏ, tăng hoặc giảm nồng độ của một số thành phần trong môi trường nuôi cấy (muối, đường hoặc tannin, v.v.), một môi trường phát triển không phù hợp sẽ được tạo ra, khiến chúng không thể phát triển được. tiếp tục phát triển và cái chết. Một số nghiên cứu đã phát hiện ra rằng việc loại bỏ VB1, VB6, axit nicotinic và các thành phần hữu cơ khác (giữ lại myo-inositol) trong môi trường nuôi cấy quả hồ trăn có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vật liệu.
2.3.3 Đ𝑖𝑒̂̀𝑢 𝑐ℎ𝑖̉𝑛ℎ đ𝑜̣̂ 𝑝𝐻 𝑐𝑢̉𝑎 𝑚𝑜̂𝑖 𝑡𝑟𝑢̛𝑜̛̀𝑛𝑔 𝑛𝑢𝑜̂𝑖 𝑐𝑎̂́𝑦
Giá trị pH có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của các enzyme trong tế bào vi khuẩn và nấm, tính thấm của màng tế bào, sự vận chuyển các chất trong và ngoài tế bào và hô hấp tế bào. Ngoại trừ Erwinia spp., hầu hết vi khuẩn không thể phát triển ở pH ≤ 4,5. Do đó, có thể tránh được một lượng lớn ô nhiễm vi khuẩn bằng cách điều chỉnh độ pH của môi trường nuôi cấy một cách thích hợp.
𝟑. 𝐁𝐢𝐞̣̂𝐧 𝐩𝐡𝐚́𝐩 𝐤𝐡𝐚̆́𝐜 𝐩𝐡𝐮̣𝐜 𝐬𝐚𝐮 𝐤𝐡𝐢 𝐨̂ 𝐧𝐡𝐢𝐞̂̃𝐦 𝐱𝐚̉𝐲 𝐫𝐚
3.1 𝑩𝒐̂̉ 𝒔𝒖𝒏𝒈 𝒌𝒉𝒂́𝒏𝒈 𝒔𝒊𝒏𝒉 𝒕𝒓𝒐𝒏𝒈 𝒏𝒖𝒐̂𝒊 𝒄𝒂̂́𝒚 𝒎𝒐̂ 𝒏𝒉𝒊𝒆̂̃𝒎 𝒌𝒉𝒖𝒂̂̉𝒏
Nhiễm vi khuẩn thường biểu hiện như: khuẩn lạc vi khuẩn phân bố trên bề mặt môi trường nuôi cấy, có hình dạng giống chất nhầy hoặc đục như nước, thậm chí lên men sủi bọt. Trong đó, ô nhiễm do Bacillus gây ra là phổ biến và nghiêm trọng nhất. khuẩn lạc có màu trắng sữa, hình giọt nước như đám mây.
Sử dụng táo Bắc Mỹ làm vật liệu thử nghiệm, thêm 250 mg/L carbenicillin và 50 mg/L kanamycin vào môi trường nuôi cấy và tiến hành ba lần nuôi cấy liên tiếp, có thể thu được vắc xin không tăng trưởng ổn định. Nồng độ penicillin G là 400mg/L, có thể kiểm soát hiệu quả sự ô nhiễm nội sinh của cây giống dâu tây 'Zhangji'.
3.2 𝑩𝒐̂̉ 𝒔𝒖𝒏𝒈 𝒕𝒉𝒖𝒐̂́𝒄 𝒅𝒊𝒆̣̂𝒕 𝒏𝒂̂́𝒎 𝒕𝒓𝒐𝒏𝒈 𝒏𝒖𝒐̂𝒊 𝒄𝒂̂́𝒚 𝒎𝒐̂ 𝒏𝒉𝒊𝒆̂̃𝒎 𝒏𝒂̂́𝒎
Nhiễm nấm trong nuôi cấy mô thường biểu hiện dưới dạng sợi nấm màu trắng, đen, xanh lá cây và các màu khác nhau trong thùng nuôi cấy. Những loại phổ biến nhất là Aspergillus, Mucor và Penicillium. Các loại thuốc diệt nấm thường được sử dụng bao gồm carbendazim, mancozeb, chlorothalonil, v.v.
Các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng có thể loại bỏ ô nhiễm nấm bằng cách ngâm các vật liệu bị nhiễm nấm trong dung dịch vô trùng carbendazim 3% trong hơn 0,5 giờ rồi cấy chúng vào. Việc bổ sung 75% mancozeb vào môi trường nuôi cấy có tác dụng phòng ngừa và kiểm soát đáng kể tình trạng nhiễm nấm xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô của các loài lan trên cạn như hoa lan. Sử dụng môi trường chứa 0,05% carbendazim trong giai đoạn hạt nảy mầm và sử dụng môi trường chứa 0,05% chlorothalonil trong giai đoạn phát triển của cây con có thể ức chế đáng kể ô nhiễm nuôi cấy mô. Acetomycin và streptomycin có tác dụng diệt khuẩn và nấm nuôi cấy mô tốt, acetogarin chịu được nhiệt độ cao và có thể thêm trực tiếp khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
3.3 𝑺𝒖̛̉ 𝒅𝒖̣𝒏𝒈 𝒄𝒂́𝒄 𝒉𝒐́𝒂 𝒄𝒉𝒂̂́𝒕 𝒌𝒉𝒂́𝒄
. Một số nghiên cứu đã phát hiện ra rằng chiết xuất thô của các cơ quan ăn được của gừng, hành tây, tỏi và mướp đắng có tác dụng ức chế nhất định đối với vi khuẩn gây ô nhiễm mô nuôi cấy so với kháng sinh, chất kìm khuẩn thực vật có độc tính thấp, dư lượng thấp và tác dụng tốt đối với mô.