Giải Trình Tự Sanger - Apollo Biotek

03/06/2024

Cập nhật các dịch vụ tại Apollo Biotek.

Cần định danh, nhanh tay liên hệ Apollo, hotline: 079 474 0275.

29/02/2024

Chào ngày mới, mọi người làm đề tài tới đâu rồi!!!

29/02/2024

15/02/2024

Hết tết rồi, quay lại với đề tài thôi👩‍🎓🧑‍🎓👩‍🎓.
Giải trình tự Sanger sản phẩm PCR, Giải trình tự định danh vi khuẩn, nấm, động thực vật ( có kết quả sau 3-5 ngày ).

13/02/2024

Thầy nói chỉ có đúng

13/02/2024

🎯🎯🎯Tổng quan về phương pháp Pyrosequencing (PHẦN 2)

Tóm tắt điểm khác biệt giữa Pyrosequencing và Sanger Sequencing

Trình tự Sanger và Pyrosequencing là hai phương pháp lập trình DNA được sử dụng trong sinh học phân tử. Trình tự Sanger cấu trúc trình tự của các nucleotide theo trình tự bằng cách chấm dứt sự kéo dài chuỗi, trong khi pyrosequencing xây dựng thứ tự chính xác của các nucleotide theo trình tự bằng cách kết hợp nucleotide và phát hiện ra sự phóng thích của pyrophosphates. Vì vậy, sự khác biệt chính giữa trình tự Sanger và Pyrosequencing là giải trình tự Sanger làm việc theo trình tự bằng cách chấm dứt chuỗi, trong khi pyrosequencing làm việc theo trình tự bằng tổng hợp

Sau đây là bảng so sánh 2 kỹ thuật này và ứng dụng của từng kỹ thuât tại thời điểm hiện tại

13/02/2024

🎯🎯🎯Tổng quan về phương pháp Pyrosequencing (PHẦN 1)
Công nghệ pyrosequencing dựa trên cơ sở pyrophosphate (PPi) được giải phóng khi nucleotide tự do mới được gắn vào chuỗi trong quá trình tổng hợp sợi DNA. Sau mỗi nucleotide tự do được gắn vào sợi khuôn trong quá trình tổng hợp, PPi giải phóng được phát hiện nhờ phức hợp enzyme chuyển thành tín hiệu quang học và được phát hiện bởi một CCD cực nhạy.

Công nghệ Pyrosequencing cũng là 1 loại giải trình tự bởi quá trình sinh tổng hợp (Sequencing by Synthesis - SBS) hay còn gọi là Real-time Sequencing Nguyên lý gồm các bước sau:

Bước 1: Một đoạn DNA được khuếch đại và sợi làm bản mẫu cho pyrosequencing được biotin hoá. Sau khi biến tính, sợi đơn PCR amplicon được phân lập và được lại với một primer giải trình tự.

Bước 2:

Phức hợp lai của primer và sợi đơn khuôn được ủ với phức hợp men (enzyme) DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, and apyrase và các cơ chất adenosine 5 'phosphosulfate (APS) và luciferin
Bước 3

Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) đầu tiên được thêm vào phản ứng. DNA polymerase xúc tác gắn thêm dNPT vào primer giải trình tự, nếu nó bổ sung với trình tự sợi khuôn. Mỗi một sự kiện gắn vào đó đi kèm với việc giải phóng pyrophosphate (PPi). Số phân tỷ PPi giải phóng bằng với số nucleotide được gắn vào.
Bước 4

ATP sulfurylase biến đổi PPi thành ATP với sự hiện diện của APS. Phân tử ATP này điều khiển việc chuyển hoá luciferin thành oxiyluciferin dưới sự xúc tác của luciferase tạo ra ánh sáng khả kiến tỷ lệ thuận với số phân tử ATP. Ánh sáng được tạo ra trong phản ứng luciferase xúc tác được phát hiện bởi các cảm biến CCD (CCD senser) và được nhìn thấy thành các đỉnh trong dữ liệu đầu ra thô (Pyrogram®). Độ cao của mỗi đỉnh (light signal) tỷ lệ thuận với nu được gắn vào
Apyrase liên tục phân giải nucleotide (dNTP) không được gắn vào (không bổ với mạch khuôn) và các ATP sinh ra. Khi quá trình phân giải hoàn thành, một nucleotide khác được thêm vào

Quá trình thêm các dNTP được tiến hành tuần tự. Lưu ý deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPαS) được sử dụng thay thế cho deoxyadenosine triphosphate (dATP) có có hoạt tính với DNA polymerase, nhưng không phải được nhận biết bởi luciferase. Khi quá trình này tiếp tục, các sợi DNA bổ sung được kéo dài và trình tự nucleotide được xác định từ các đỉnh tín hiệu trong phổ Pyrogram.

13/02/2024

🎯ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SANGER PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ DNA TY THỂ
Ty thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bào. DNA ty thể có tỷ lệ đột biến cao hơn so với DNA nhân và đột biến DNA ty thể là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở người. Một nhóm nghiên cứu thuộc bệnh viện Đại Học Y Dược TP.HCM đã thiết kế thành công 8 cặp mồi dùng để nhân bản toàn bộ 37 gen ở mtDNA từ đó tiến hành giải trình tự bằng phương pháp Sanger giúp phát hiện các đột biến trên DNA ty thể góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình bệnh nhân mắc các bệnh lý rối loạn ty thể.

“Nhà máy năng lượng” ty thể
Ty thể là nhà máy năng lượng cho cơ thể chúng ta. Mỗi một tế bào có khoảng vài nghìn ty thể. Nhiệm vụ của nhà máy này là thực hiện quá trình hô hấp tế bào để chuyển hóa các chất từ thức ăn đã hấp thụ thành nguồn năng lượng. Ty thể sản xuất 90% năng lượng mà cơ thể chúng ta cần cho các hoạt động. Điều đặc biệt là ty thể có hệ DNA riêng (mtDNA) tồn tại ở dạng mạch kép vòng, có kích thước 16.569 bp, với 37 gen mã hóa cho 2 RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi truyền điện tử hô hấp tế bào. DNA ty thể (mtDNA) dễ bị hư hại do nó giàu các gốc oxy hóa tự do (ROS: reactive oxygen species) và thiếu cơ chế sửa sai hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến xuất hiện trong mtDNA. Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai sót trong mtDNA có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng đến nhiều tế bào, mô và các cơ quan khác nhau.

Các bệnh lý ty thể
Bệnh lý rối loạn ty thể là bệnh lý trong đó khả năng sản xuất năng lượng và vai trò bình thường của ty thể trong tế bào bị tổn hại. Các bệnh lý rối loạn ty thể có ảnh hưởng đến nhiều cơ quan, tập trung chủ yếu vào cơ, hệ thần kinh, các cơ quan cần nhu cầu năng lượng cao và các chuyển hóa của cơ thể. Hiện nay, đã có nhiều bệnh lý rối loạn ty thể được phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hội chứng MELAS (Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes), hội chứng MERRF (Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres), bệnh thần kinh thị giác di truyền Laber (LHON: Laber hereditary optic neuropathy), hội chứng Leigh, bệnh NARP (Neurogenic muscle weakness, ataxia, and retinitis pigmentosa), bệnh CPEO (Chronic progressive external ophthalmoplegia)… Biểu hiện lâm sàng của những bệnh lý này rất đa dạng, có những triệu chứng đan xen nhau. Sự khởi phát các triệu chứng lâm sàng, sự biến đổi kiểu hình và mức biểu hiện của bệnh lý rối loạn ty thể chịu sự chi phối của nhiều yếu tố như hiệu ứng ngưỡng, sự phân chia tế bào chất trong phân bào, số lượng bản sao DNA được nhân lên trong ty thể và sự di truyền “nút thắt cổ chai”. Do đó, bệnh có thể bắt đầu xuất hiện ngay sau khi sinh hoặc cũng có thể xảy ra ở bất kỳ lứa tuổi nào.

Theo ước tính tỷ lệ bệnh ty thể khoảng 1/5000 người. Cứ mỗi năm có từ 1000 đến 4000 trẻ em ở Mỹ sinh ra mắc bệnh lý ty thể. Do triệu chứng và nhiều hệ cơ quan bị ảnh hưởng nên các bệnh lý ty thể thường bị chẩn đoán nhầm sang các bệnh lý khác thông thường hơn. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh lý rối loạn ty thể để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền của bệnh. Tuy nhiên, tại Việt Nam, ít có công trình nghiên cứu giải trình tự toàn bộ mtDNA. Do đó, nghiên cứu này nhằm góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình bệnh nhân mắc các bệnh lý rối loạn ty thể.

Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự Sanger phát hiện các biến thể DNA ty thể

Tác giả Lê Khái Phương và các cộng sự đã tiến hành thiết kế primer khuếch đại toàn bộ 37 gen của DNA ty thể thông qua 8 phản ứng PCR. Sản phẩm PCR sau khi kết thúc chu trình luân nhiệt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%, cho thấy các băng sản phẩm mục tiêu sáng rõ nét, không có band phụ (Hình 1). Sau đó, sau đó tiến hành giải trình tự 8 vùng gen này bằng phương pháp Sanger và thống kê các vị trí đột biến.





Trong 43 mẫu bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh lý liên quan rối loạn ty thể được giải trình tự DNA ty thể, đã phát hiện 19 trường hợp mang đột biến (chiếm tỷ lệ 44,19%), trong đó 01 trường hợp mang đột biến kép (xảy ra 2 đột biến đồng thời). Các dạng đột biến được mô tả trong Bảng 1 và Hình 2.

Trong 19 trường hợp phát hiện đột biến, m.3243A>G và m.3697G>A là những đột biến điểm liên quan đến hội chứng MELAS [1,2]. Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 3243 trên gen MT-TL1 của DNA ty thể làm thay đổi bộ ba mã hóa trên tRNALeu, do đó giảm khả năng tương tác với bề mặt ribosome. Đột biến tại vùng này ảnh hưởng đến sự hợp nhất của dư lượng leucine vào protein ty thể, làm suy yếu tổng hợp protein và gây ra các rối loạn chức năng của chuỗi hô hấp trong ty thể. Trong khi đó, đột biến m.3697G>A xảy ra trên gen MT-ND1 có chức năng mã hóa các protein trong tiểu đơn vị của phức hợp I (NADH dehydrogenase) trong chuỗi truyền điện tử hô hấp tế bào. Đột biến này làm thay đổi glycine (amino acid có tính bảo tồn cao và nằm ở vị trí domain xuyên màng) thành serine tại vị trí 131. Do đó, các đột biến này làm ty thể giảm hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, đặc biệt là các phức hợp I và IV (cytochrome C oxidase).

Đột biến m.8344A>G là đột biến điểm phổ biến liên quan hội chứng MERRF. Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 8344 trên gen MT-TK làm thay đổi bộ ba mã hóa trên tRNALys. Hậu quả của đột biến này tương tự như đột biến m.3243A>G, tức là làm giảm khả năng tương tác giữa tRNALys với bề mặt ribosome, từ đó ảnh hưởng đến sự hợp nhất của dư lượng lysine vào protein ty thể

Đột biến m.3394T>C (p.Y30H) trên gen MT-ND1, đột biến m.12338T>C (p.M1T) và m.13708A>G (p.A458T) trên gen MT-ND5 đều được ghi nhận tồn tại ở dạng đồng tế bào chất hay đồng DNA ty thể (homoplasmy, các bản sao của DNA ty thể đều giống nhau) và có liên quan với bệnh LHON. Đặc biệt, đột biến m.13708A>G còn được ghi nhận làm tăng nguy cơ mắc bệnh Alzheimer và ung thư vú. Các đột biến này ảnh hưởng đến cấu trúc và sự ổn định của phức hợp I trong chuỗi truyền điện tử hô hấp tế bào, khiến cho quá trình tổng hợp ATP và điện thế màng ty thể giảm, tăng sản xuất ROS.

Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng đã ghi nhận 01 trường hợp mang SNP m.3970C>T trên gen MT-ND1. Biến thể này được ghi nhận trong quần thể người Mông Cổ ở Trung Quốc chiếm tỷ lệ 10,38%. Mặc dù biến thể này là một đột biến đồng nghĩa (không ảnh hưởng đến cấu trúc của protein) nhưng nhiều nghiên cứu cho rằng biến thể này có thể cùng với một vài biến thể khác tạo thành một haplotype làm tăng nguy cơ mắc bệnh tăng huyết áp, ung thư đại trực tràng, bệnh Behçet.

Ty thể là bào quan sử dụng oxy để chuyển hóa các sản phẩm trung gian của thức ăn thành năng lượng thông qua một quá trình phosphoryl oxy hóa. Những đột biến trên DNA ty thể gây ra các bệnh lý rối loạn ty thể như hội chứng MELAS, hội chứng MERRF, bệnh LHON… sẽ làm suy giảm khả năng của ty thể trong việc tạo ra các protein, sử dụng oxy và sản xuất năng lượng. Nhìn chung, những tác động của đột biến mtDNA lên bệnh nhân là khá đa dạng, phức tạp và không đồng nhất. Các rối loạn của các bệnh lý rối loạn ty thể ảnh hưởng đến nhiều bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện từ thời thơ ấu hay tuổi vị thành niên. Vì vậy, việc phân tích mtDNA là quan trọng ở nhiều trường hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng.

Tại Việt Nam , các đơn vị y tế được trang bị chủ yếu là giải trình tự theo phương pháp Sanger, đề tài này giúp tận dụng nguồn cơ sở vật chất hiện có và hỗ trợ cho công tác chẩn đoán , điều trị bệnh, đồng thời tạo nguồn cơ sở dữ liệu gen ty thể của người Việt.

Nguồn:

Lê Khái Phương và CS, “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SANGER PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ DNA TY THỂ,” Tạp chí Y Học , tập 518, tháng 9, số 2 -2022.

13/02/2024

🎯CÁC KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ (PHẦN CUỐI)
3. Giải trình tự thế hệ mới – Next-generation sequencing (NGS)

NGS là công nghệ cho phép giải mã đồng thời hàng triệu đoạn ADN trong cùng lúc, qua đó giúp nâng cao hiệu suất của quá trình giải mã hệ gen người. Công nghệ NGS có những ưu điểm: Thời gian đọc nhanh, dữ liệu đầu ra lớn và tiết kiệm chi phí hơn, khắc phục một số nhược điểm của giải trình tự gen truyền thống. Các kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới có thể xem là sự kết hợp của sinh học, hóa học, công nghệ nano và cả sinh tin học.Giải trình tự thế hệ mới đang không ngừng phát triển bởi các hãng công nghệ sinh học lớn như Illumina, Qiagen, Roche, …

Bạn có thể tham khảo thêm các phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới thông qua đường link:

https://tapchisinhhoc.com/giai-trinh-tu-gen-the-he-moi.html/

13/02/2024

🎯CÁC KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ (PHẦN 2)

2. Giải trình tự bằng phương pháp kết thúc chuỗi – phương pháp Sanger
Giải trình tự Sanger được phát triển bởi nhà hóa sinh người Anh Fred Sanger và các đồng nghiệp của ông vào năm 1977. Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường (phân tử dNTP bị xử lý mất Nhóm 3’-OH trở thành phân tử ddNTP). Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Dựa trên nguyên tắc này, ta tiến hành một phản ứng tổng hợp DNA chứa cả dNTP và một lượng giới hạn ddNTP, sau phản ứng, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene.

Trong thí nghiệm của Sanger, sử dụng 4 ống nghiệm chứa 4 loại ddNTP khác nhau được đánh dấu đồng vị phóng xạ đồng thời được thực hiện phản ứng tổng hợp. Sau đó sản phẩm của 4 ống nghiệm được điện di hiện hình đồng vị phóng xạ trên cùng một bản gel để quan sát các band DNA. Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát được trên bản gel mà xác định trình tự các nucleotide theo chiều từ 5 -3 từ dưới lên trên.

Ngày nay người ta sử dụng các máy giải trình tự động để sắp xếp trình tự các band điện di. Kỹ thuật giải trình tự DNA tự động (Dye temination sequencing) sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn. Mỗi loại ddNTP được gắn một màu có bước sóng phát xạ huỳnh quang khác nhau cho phép thực hiện giải trình tự trong một phản ứng duy nhất (Hình 4).

Hệ thống điện di mao quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động. Cấu tạo của máy gồm 4 cho tới 24 mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu trong một lần điện di. Hệ thống detector gồm các camera có chùm tia laser đi qua nó để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang một cách chính xác. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độ đỉnh sáng (peak) trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với nhau và phân tích thành trình tự của đoạn DNA.

Giải trình tự Sanger không hiệu quả đối với các dự án quy mô lớn hơn, chẳng hạn như giải trình tự của toàn bộ gen. Các kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới cũng lần lượt ra đời đáp ứng cho nhu cầu giải trình tự bộ gen kích thước lớn. Tuy nhiên, cần nhấn mạnh là ,giải trình tự Sanger mang lại trình tự có độ chính xác cao đối với cho các đoạn DNA có chiều dài lên đến khoảng 900 bps, thao tác thực hiện đơn giản dễ tiếp cận. Do đó , giải trình tự bằng phương pháp Sanger thường được sử dụng cho các đoạn DNA riêng lẻ, chẳng hạn như plasmid của vi khuẩn hoặc trình tự DNA đích được khuếch đại sau phản ứng PCR.

13/02/2024

🎯CÁC KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ (PHẦN 1)

1. Giải trình tự bằng phương pháp hóa học – Maxam-Gilbert sequencing
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học để có thể giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên tắc của phương pháp này là:

(1) Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P);

(2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA. Ví dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng cách thêm một gốc methyl ở vị trí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine và NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine và Adenine, NaOH để làm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine. Như vậy trong giai đoạn này, phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, DNA được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi;

(3) Các nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường-phosphate (sugar-phosphate backbone) của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung (hình 1).

(4) Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biến đổi trong quá trình điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P. Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự của các nucleotide của đoạn DNA (hình 2)
Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert cho phép sử dụng các mẫu DNA mà không cần nhân bản thêm. Do sử dụng nhãn phóng xạ và độ phức tạp của kỹ thuật, phương pháp này không được khuyến khích việc sử dụng.